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案例展示

【Neuron】大 麻受体与小鼠应激反应的关系

发布时间:2020-06-19

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压力暴露是导致严重抑郁、焦虑和物质使用障碍等精神疾病发展和恶化的主要危险因素。此外,严重的压力会*终发展为创伤后应激障碍(PTSD)。在此背景下,了解压力暴露转化为独特的病理行为、情绪和认知领域的分子、细胞和环路水平的机制可能具有很多的临床意义。此外,阐明压力与情感性精.神病理之间的分子机制可以揭示减轻压力对精神健康不良影响的新治.愈方法。尽管许多压力调节神经调控信号系统的识别已经揭示了情感性疾病潜在的新的治.愈靶点,内源性大的麻素(eCB)信号系统是一个主要的药。物开发候选表率。

eCB信号系统与应激反应生理学密切相关,而eCB信号的药理增强被认为是一种治.愈应激和创伤相关精神疾病的新方法。在突触水平,2-花生四烯基甘油(2-AG)介导的eCB信号是一个很多表达的逆行信号系统。具体地说,2-AG是由突触后神经元通过二酰甘油-脂肪酶(DAGLa)以活动依赖的方式产生,并激.活突触前CB1受体,降低神经递质释放的概率。2-AG被单酰甘油脂肪酶(MAGL)在突触前末端和胶质细胞中表达降解。*近的研究表明2-AG信号是一种关键的应激调节系统,2-AG增强是一治.愈应激相关精神疾病的新方法。例如,2-AG的缺乏与焦虑增加、恐惧消退受损以及对应激性焦虑的易感性增加有关。相反地,2-AG的增加可以提高压力恢复力,防止压力引起的焦虑。尽管有这些数据,2-AG与环境压力相互作用从而影响情绪行为的精确的细胞和环路水平的机制还没有被很好地理解。

过去十年的研究已经阐明了在调节压力反应、焦虑和情绪调节方面连接情绪和认知控制中心的不同的大脑环路。例如,在人类中,当暴露于威胁刺激时,背内侧前额叶皮层(dmPFC)和杏仁核表现出兴奋性耦合,杏仁核-dmPFC环路的增强活动与焦虑的主观评级相关。与这些发现一致的是,啮齿类动物基底外侧杏仁核(BLA)激.活前边缘前额叶皮层 (plPFC)(与人类dmPFC相似的啮齿类动物)的输入,会产生焦虑样行为,并在面对不确定性时对恐惧反应产生偏见行为。*近的研究也表明,BLA-plPFC的谷氨酸能突触在应激暴露后发生突触前强化。综上所述,这些数据表明,增强的杏仁核- dmpfc(啮齿动物中的BLA-plPFC)耦合可能表率了一种将压力暴露转化为焦虑样情绪状态的保守环路机制。然而,其分子机制有助于应力诱导的BLA-plPFC回路的增强和应激暴露后焦虑样行为的产生尚不清楚。在这里,研究人员阐明了一个eCB机制,将压力暴露与BLA-plPFC亚环路特异性突触强化和持续性焦虑样行为联系起来。

 

结果

1. BLA-plPFC电路具有应激反应性和抗焦虑性

为了研究调节BLA-plPFC连通性和可塑性的分子机制,研究人员首先验证了该环路是通过暴露于压力而参与的(图1A)。利用在体光纤光度法,研究人员观察到,不可预测的足底电击应激明显增加了激.活plPFC的BLA轴突终末突触前Ca2+内流,并对休克开始起定时锁定作用(图1B和1C)。接下来,研究人员使用Inscopix在体超微显微成像技术对体内单细胞Ca2+成像来检测plPFC神经元对足底电击的反应。整个视野内神经元Ca2+信号随电击暴露而增加(图1D和1E),随后的单细胞分析显示了三种不同的神经元种群:应激兴奋性(44.40%)、应激性(38.43%)和应激无反应性(17.16%)(图1F和1G)。(兴奋性:|z| = 3.83,抑.制性:|z| = 2.62,双尾t检验p = 0.0073),合成平均信号为兴奋性(z = 1.09;图1H),提示应激诱导的plPFC神经元兴奋多于抑.制。这些数据表明,压力暴露参与了BLA-plPFC环路,并导致了plPFC神经元活性的增强。

压力暴露是焦虑障碍发展的普遍危险因素,啮齿动物的压力暴露可以模拟许多与情感性障碍相关的精神.病理领域。事实上,在足底电击应激暴露24小时后,研究人员观察到在高架零迷宫(EZM)中焦虑样行为的增加(图1I)。为了测试是否可以通过直接激.活BLA-plPFC环路来再现“应激样”状态,研究人员使用了一种交叉的化学发生方法来具体增强投射到plPFC的BLA神经元的兴奋性(图1J)。研究人员使用全细胞电流钳电生理学方法研究了氯氮平氮氧化物(CNO)应用后,plPFC投射的BLA锥体神经元表达的hM3D设计受体被设计药。物(GqDREADD)激发的兴奋性动作电位(APs)特异性激.活(图1K)。在BLA(图1L)和mPFC(图1M)中,给予CNO也可诱导cFOS的稳健表达。此外,尽管应激导致plPFC神经元的激.活(图1 d和1 e),但在GqDREADD激.活BLA-plPFC神经环路后,应激没有导致cFOS在BLA(n = 6,p = 0.6418)或plPFC (n = 6,p = 0.0855)的表达的进一步增加,表明应激GqDREADD激.活.补充了重叠BLA-plPFC神经环路。在高架十字迷宫(EPM)中,该环路的化学发生激.活明显增强了焦虑样行为(图1N)。这些数据表明,在小鼠中,BLA-plPFC回路是应激响应的,其激.活是焦虑源性的,提示应激诱导的焦虑样行为可以通过增强BLA-plPFC环路功能来介导。

 

图1 压力暴露会激.活焦虑性的BLA-plPFC回路

(A)压力暴露和行为分析的示意图和时间表。

(B)活.体内BLA投射到plPFC的光纤测光记录示意图。

(C)2-s 0.5 ma的足底冲击下,plPFC中表达BLAGCaMP6s记录的DF/F信号Z值。痕迹表示4 - 5只小鼠的平均值,每只小鼠的痕迹来自20次电击试验的平均值(应激:n = 5,对照组:n = 4)

(D)基于内窥镜的plPFC神经元体内Ca2+成像原理图。

(E)视野中总GCaMP7f信号在2-s 0.5 ma英尺冲击下记录的体DF/F Z评分。Trace表示4只小鼠的平均值,每只小鼠的Trace来自20次电击试验的平均值(n = 4)

(F)表率性小鼠Ca2+信号的微内镜大投影图像及细胞轮廓提取。

(G)表达gcamp7fplPFC神经元对足部电击表现出兴奋性、或无反应的比例(4只小鼠共268个细胞)

(H)兴奋性Z分数(n = 119),抑.制性Z分数(n = 103),平均兴奋性和反应Z分数(n = 222)Peak 兴奋 Z 分数 = 3.83 ,较高 抑.制 Z 得分 = = 1.09. 2.14,峰值 平均

(I)足电击应激对零海拔迷宫焦虑样行为的影响(无应激:n = 10,应激:n = 15)。开臂时间(p < 0.0001)、开臂入口(p < 0.0001)、总距离(p < 0.0001)、静止时间(p = 0.0003)

(J) hM3Dq (GqDREADD)BLA-plPFC电路中表达的病.毒间途径示意图。

(K)显示cno诱导的动作电位放电的BLA神经元的数量和比例(n = 134只小鼠)

(L)体内给药10 mg/kg CNOBLA神经元cFOS表达的表率性图像及定量(mCherry: n = 8GqDREADD: n = 8). mCherryGqDREADDp < 0.0001

(M)体内给药10 mg/kg CNOplPFC神经元cFOS表达的表率性图像及定量(mCherry: n = 8GqDREADD: n = 8). mCherryGqDREADDp < 0.0001

(N) CNO (5 mg/kg)对上升迷宫(EPM)中焦虑样行为的影响(GqDREADD: N = 9mCherry: N = 8). %开放+中心时间(p = 0.0378),开放+中心入口(p = 0.0268),总距离(p = 0.0067),静止时间(p = 0.0119)。误差条均为±SEM;n表率行为研究中神经元的数量或小鼠的数量。p值来自双尾不配对t检验(ILMN)

 

2. 应激暴露增强了BLA-plPFC互反电路中的兴奋性信号

数据表明,增强的BLA-plPFC环路活性可能是环境压力转化为焦虑样行为的相关底物。为了研究在BLA-plPFC电路中受到压力诱导的突触适应性,使用了顺行chr2辅助投射靶向、逆行追踪方法和体外电生理学相结合的方法(图2A和2B)。将顺行性腺相关病.毒aav5 - camki -ChR2- eyfp (ChR2)与逆行性AAV2-CAG-td-Tomato (rAAV)共注射入BLA后4 ~ 6周,处死小鼠进行体外电生理研究。

足底电击后24小时,研究人员观察到,rAAV+ L2/3 plPFC神经元中,BLA源性oEPSC振幅增加,配对脉冲比(PPR)下降(图2C-2E),应激后,在一个互反的BLA-plPFC-BLA子环路中,谷氨酸释放概率增加。这种增强的兴奋性驱动伴随着rAAV+ L2/3神经元突触驱动的动作电位放电概率的增加和这些神经元固有的兴奋性的少量但明显的增加(图2F和2G)。

研究人员还观察到,在L2/3rAAV+神经元上,光遗传诱导的异步EPSCs(o-aEPSCs)的频率增加,但幅度没有增加,证实了应激暴露后24小时BLA-plPFC突触的突触前释放概率增加(图2H)。相反,L2/3rAAV神经元的兴奋性输入(图2J)、PPR(图2K)或躯体驱动AP放电(图2L)在应激后没有明显变化。在L2/3 rAAV中观察到的变化是神经元光基因诱发的动作电位放电明显减少(图2M)。

 

3. 内源性大的麻素信号很多地抑.制从BLA到plPFC的谷氨酸能输入

鉴于观察到的应激诱导的BLA-plPFC谷氨酸能传递的增加是由增强的突触前释放介导的,研究人员接下来试图确定这种效应的驱动机制。众所周知,逆行作用的ECBs,即anandamide(AEA)和2-AG,受到应激的调节,并调节PFC中的突触传递,这增加了这个神经调制系统中的功能损伤可能有助于应激暴露后BLA-plPFC突触突触前驱动增加的可能性。为了验证这一假设,研究人员首先证明了大的麻素受体激动剂cp55,940在rAAV+和rAAV中强烈地抑.制了血乳酸诱发的oEPSC振幅。L2/3plPFC神经元,表明BLA投射到plPFC受到大的麻素受体的很多调节(图3A、3B、3E和3F)。为了确定ECBs是否调节BLA-plPFC谷氨酸能传递,研究人员分析了去极化诱导的兴奋抑.制(DSE),这是一种典型的2-AG介导的短期突触抑.制,突触后短暂的去极化导致2-AG的产生,并通过与突触前CB1受体结合抑.制谷氨酸的释放。研究人员发现,突触后10s去极化至+30 mV诱导的DSE在L2/3rAAV+和rAAV上均有表达。CB1反向激动剂利莫那班或DO34是2-AG生物合成限速酶(DAGL)的抑.制剂(图3C和3G)。有趣的是,这两个化合物单独诱导了PPR的明显降低,表明2-AG-CB1信号可以紧张性地抑.制BLA-plPFC突触的谷氨酸释放(图3D和3H)。为了确保利莫那班对PPR的影响是由于阻断紧张性ECB信号而不是其反向激动剂特性,研究人员用中性CB1拮抗剂NESS0327(Ness)重复了这一实验。Ness和利莫那班都阻断DSE,降低PPR,并导致更大的oEPSC振幅,进一步支持ECB对BLA-plPFC谷氨酸能突触的紧张性控制。鉴于强直的ECB信号通常被归因于AEA,而不是2-AG(Kim和Alger,2010),研究人员通过证明利莫那班和DO34都增加了o-aEPSCs的频率,但没有增加幅度,从而增强了研究人员的PPR实验,证实了这些突触上的强直的2-AG-CB1信号(图3I-3K)。这些数据为BLAplPFC突触很多表达的多模态强直相2-AG介导的突触前神经递质释放的调节提供了证据。为了检查ECB信号在plPFC中的输入特异性,研究人员在检查MDT向plPFC的投射时进行了相同的关键实验。众所周知,MDT具有低CB1的表达,因此,研究人员几乎没有观察到CP55,940诱导的oEPSC幅度的抑.制和没有DSE,这表明ECB调节plPFC中的兴奋性传递具有电路水平的特异性。

 

4. 应激破坏了对BLA-plPFC互易谷氨酸能回路的2-AG抑.制

在观察到应激增加了BLA-plPFC相互回路内的突触前释放概率,以及进入plPFC的BLA输入受到2-AG信号的高度调控后,研究人员接下来试图确定应激诱导的突触增强是否是由BLA-plPFC 2-AG信号的动态重构介导的。使用质谱,研究人员观察到应激暴露24小时后降低了mPFC中2-AG的水平,这与之前在其他大脑区域的研究一致 (图4A)。此外,在应激小鼠的mPFC中,花生四烯酸(AA)(2-AG水解的主要降解产物)的体积水平也明显降低(图4B)。这些数据表明,应激暴露可以下调mPFC中2-AG的合成,因为2-AG和AA的水平在应激暴露后都同样降低;为了支持这一点,用MAGL抑.制剂JZL184抑.制2-AG水解增加了2-AG,减少了AA(图4A和4B)。重要的是,用JZL184升高2-AG水平反转,而用DO34降低2-AG水平会加剧EZM中应激诱导的焦虑样行为的增加,支持2-AG信号可以双向调节应激诱导的焦虑的概念(图4C)。研究人员发现JZL184的抗焦虑作用需要CB1受体的可用性。

研究人员接着验证了这一假说,即应激诱导的BLA-plPFC相互回路的加强是由2-AG介导的对BLA-plPFC谷氨酸能传递的抑.制崩溃所介导的。研究人员再次发现,应激使L2/3rAAV+神经元选择性地增加突触前释放概率,表现为应激后24小时的PPR降低(图4D和4E)。有趣的是,尽管沐浴应用DO34降低了非应激小鼠的PPR,但这种作用在应激动物中被阻断了。此外,DO34的应用阻断了应力诱导的PPR的进一步降低。相反,在BLA-L2/3rAAV+突触应用JZL184对2-AG信号的药理增强能够以CB1依赖的方式选择性地挽救这种应激诱导的PPR下降(图4E和S5A)。在BLA-L2/3rAAV+突触中,2-AG信号的药理增强能够选择性地挽救这种应激诱导的PPR下降(图4E和S5A)。在2-AG时相信号方面也观察到了类似的模式,因为应激降低了L2/3rAAV+神经元的DSE幅度,这种效应可以通过JZL184孵育而得到挽救(图4F和4G),这种效应依赖于应激源的强度,并在应激暴露后3天恢复。根据PPR观察,预先应用利莫那班可以阻断JZL184对DSE的影响。L2/3rAAV_神经元(图4H-4K)和L5神经元(数据未显示)未观察到应激诱导的变化。这些数据表明,应激诱导的BLA-plPFC突触的相位和强直2-AG信号的崩溃可能有助于应激诱导的BLA-plPFC电路的加强和随后焦虑样行为的表达(图4L)。有趣的是,雌性小鼠没有表现出应激诱导的DSE幅度的降低,这表明应激对强直性和相性2-AG信号的影响可能在性别之间有所不同。然而,DSE在2MT暴露时受损,表明2-AG信号崩溃不是应激源特有的。为了进一步支持应激诱导的2-AG-CB1对BLA兴奋性输入的调节功能崩溃,研究人员证明了应激阻断了利莫那班和NESS增加OEPSC幅度的能力,完全阻断了NESS降低PPR的能力,同时部分阻断了利莫那班降低BLA-L2/3plPFC rAAV+突触PPR的能力。

研究人员的质谱数据显示,应激暴露后mPFC的AEA水平也降低(图S5D)。这暗示了压力也可能损害BLA-plPFC电路的AEA调节。然而,与AEA降解抑.制剂PF3845孵育,既不影响基础PPR,也不挽救应激诱导的PPR或DSE幅度的下降,表明AEA不强烈调节BLA-plPFC谷氨酸能传递。此外,应激暴露不影响大的麻素激动剂诱导的BLA-L2/3plPFC突触的突触抑.制,这表明应激损害了2-AG水平,而不是影响CB1受体的敏感性。

 

5. 前缘DAGLa缺失增加了BLA-plPFC突触强度和焦虑样行为

到目前为止,数据表明,2-AG在限制从BLA到plPFC的兴奋性输入方面起着至关重要的作用,应激暴露以一种电路特异性的方式损害了这一信号的有效性,有助于应激后突触的加强。这些数据表明,plPFC内的2-AG信号缺失可能通过增强应激后的BLA-plPFC谷氨酸能偶联而导致焦虑样行为的产生。为了从实验上解决这一假设,研究人员利用了有条件的DAGLa基因敲除小鼠。研究人员首先证明了在DAGLaf/f小鼠的plPFC内立体定向注射AAV-Cre可导致plPFC中DAGLa蛋白的选择性减少,但不能导致相邻的边缘下PFC(IlPFC)中DAGLa蛋白的选择性减少(图5A)。使用plPFC特异性的DAGLa基因敲除结合上述向BLA注射ChR2和rAAV2-TD-Tomato,研究人员发现BLA-plPFC谷氨酸能突触的DSE明显受损,PPR明显下降,这概括了应激暴露后观察到的突触表型(图5B-5D)。与这种应激样突触表型相一致的是,plPFC特异性DAGLa缺失引起了类似于应激暴露后观察到的引起焦虑的行为表型(图5e)。这一行为特征在暴露于压力后持续存在,在另一组小鼠中进行了检测,表明plPFC 2-AG信号在调节类似焦虑的行为方面发挥了关键作用(图5F)。这些数据表明,受损的plPFC 2-AG信号导致BLA-plPFC谷氨酸能突触出现应激样突触表型,足以诱导焦虑样行为,概括了应激暴露的影响(图5G)。综上所述,研究人员的数据支持这一假设,即BLA-plPFC突触2-AG信号的应激诱导损伤可能是将应激效应转化为焦虑样行为的重要机制。

 

6. 脑环路特异性CB1缺失增加突触强度和应激诱导的焦虑样行为

为了进一步巩固2-AG-CB1信号在BLA-plPFC突触调控应激诱导焦虑中的作用,研究人员利用内含子重组酶位点启用组合靶向(INTRSECT)的方法,选择性地从投射到plPFC的BLA神经元中删除CB1受体。使用Cnr1的外显子2被loxP位点包围的小鼠(CB1f/f;图S6A-S6E),研究人员将驱动FLP重组酶和TD-番茄表达的逆行病.毒注射到plPFC中,并将驱动Cre重组酶以FLP依赖的方式表达的病.毒注射到BLA中。 将这两种病.毒注射到CB1f/f小鼠体内,可以预测到特异性地从plPFC投射的BLA神经元中删除CB1受体(图6A和6E)。使用电生理方法,研究人员首先证明了这种方法可以几乎完全从投射到plPFC的BLA神经元中去除CB1,因为与注射相同病.毒组合的野生型小鼠相比,oEPSCs对大的麻素激动剂CP55,940完全不敏感(图6B)。 在BLA-plPFC特异性CB1缺失后,通过展示BLA-plPFC特异性CB1缺失后BLA-伏核突触上完整的大的麻素受体功能,验证了该操作的电路选择性(图S6F-S6H)。与plPFC DAGLa缺失类似,研究人员发现BLA-plPFC特异性CB1缺失导致的突触表型与应激后观察到的类似,表现为PPR降低和DSE幅度降低(图6C和6D)。接下来,研究人员确定了BLAplPFC特异性CB1缺失在基线和压力暴露后的行为后果(图6E和6F)。在压力暴露之前,与对照病.毒(BLA中的plPFC rAAV-td-Tomato与fDIO-Cre-mNeonGreen结合)注射的CB1f/f窝产仔相比,BLAplPFC特异性CB1缺失并不影响EZM中的焦虑样行为(图6G)。 然而,在同一组小鼠的EPM中,从BLA-plPFC途径缺失CB1在足击应激暴露24小时后增加了焦虑样行为,这表明CB1群体在调节应激诱导的焦虑样行为中起着关键作用(图6H)。总之,这些数据支持研究人员的假设,即应激诱导的BLA-plPFC电路的加强是由2-AG-CB1信号中的电路特异性损伤介导的(图6I)。

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