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[Science文章]Inscopix钙成像显微镜发现连记忆都能够被控制

发布时间:2022-05-07

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日本京都大学医学研究生院Yasunori Hayashi研究组取得新进展。他们揭示了逐步突触可塑性事件可驱动记忆巩固的早期阶段。这一研究成果于2021年11月12日在Science上发表:Stepwise synaptic plasticity events drive the early phase of memory consolidation。研究人员使用Inscopix自由活动钙成像显微镜观察到了海马体的LTP过程在记忆形成和记忆巩固中具有重要作用,并通过一种新的神经光学技术成功消除了小鼠的记忆,并证明了在记忆巩固的早期阶段,长时程增强(LTP)的精确定位、时间和特征对记忆的形成是至关重要的。
Science-连记忆都能够被操控了-Inscopix-滔博生物.png
摘要

记忆开始编码在海马中,但随后巩固到大脑皮层。虽然突触可塑性是这些过程的关键,但其精确的时空分布仍不清楚。利用Inscopix自由活动钙成像显微技术和光遗传学方法在一个确定的时间窗口内选择性地消除长时程增强(LTP),研究人员发现突触可塑性的不同阶段发挥着不同的作用。开始阶段,在海马中起局部作用,赋予背景特异性。第二阶段,在同天的睡眠中,将这些神经元组织成同步放电的群。第二天睡眠时前扣带皮层的LTP需要进一步稳定记忆。这表明了构成记忆巩固早期阶段的可塑性事件的精确定位、时间和特征贡献。

正文

目前对场景记忆的普遍观点是,它开始编码在海马中,随后转移到其他区域,包括大脑皮层,长期存储过程称为记忆巩固。有人提出,突触可塑性可能是学习的基础,学习被认为在记忆巩固中起着关键作用。然而,突触可塑性在何时何地发生,而更复杂的问题是突触可塑性如何形成神经元表征。这主要是由于缺乏适当的实验技术来检测和修改突触可塑性。因此,研究人员应用Inscopix自由活动钙成像显微技术和光遗传学方法,选择性地消除长时程增强(LTP),而不影响基础传递或排除未来的可塑性事件。

1. sLTP的光擦除

研究人员使用基因编码的光敏剂蛋白SuperNova(SN),它允许活细胞中特定分子的发色基团辅助光失活(CALI)。在特定波长的光照下,SN产生活性氧,使其融合的蛋白质失活。在表达CFL与SN融合蛋白(CFL-SN)的非神经元细胞中,光照诱导CALI抑制了微孔板的肌动蛋白依赖的运动,这与CFL的失活一致。在海马切片培养的CFL-绿色荧光蛋白(GFP)与CA1锥体神经元中的共同表达,并以DsRed2作为填充物。在单树突棘上MNI(4-甲氧基-7-硝基氨基)谷氨酸双光子诱导sLTP后,观察到CFL-GFP的快速积累,超过了体积的增加(图1A、B)。通过在sLTP诱导后10分钟诱导CALI,CFL-GFP的富集和树突棘体积的增加均被逆转。

使用光活性GFP(PAGFP)融合肌动蛋白测试CFL-SN的CALI是否可以恢复肌动蛋白周转。在树突棘顶端的PAGFP-actin的光刺激显示了树突棘内的肌动蛋白周转,这在sLTP诱导后减慢(图1C)。然而,当sLTP诱导后进行CALI时,肌动蛋白周转恢复,脊柱体积恢复到基线水平。总的来说,这些结果与共丝状蛋白结构维持了sLTP诱导后树突棘体积的增加,以及CFL-SN的CALI可以通过破坏该结构的稳定和恢复肌动蛋白的周转来有效地逆转sLTP的观点相一致。
sLTP的光擦除-滔博生物.png
图1 sLTP的光擦除

2.sLTP光擦除的时间窗

与表达未融合SN的树突棘相比,表达了CFL-SN的树突棘在LTP后10分钟的光照导致树突棘增大减少(图1D、E)。同样,sLTP诱导30分钟后,CALI仍能有效地减少树突棘体积。然而,这种效应在50分钟后并不明显(图1F)。CALI在sLTP前1分钟作用于树突棘,对其随后的表达没有影响(图1F)。此外,CALI在未诱导sLTP的树突棘中触发,对树突棘体积没有影响,无论其原始大小如何(图1D、E)。CALI后在同一树突棘仍有可能再诱导sLTP,这表明该过程不会造成长久损伤,而只是暂时破坏了树突棘相关的可塑性机制(图1E).

3. 电生理记录的LTP也可以被光擦除
为了检测CFL-SN的CALI是否能消除电记录的LTP,研究人员在CaMKIIa-Cre小鼠海马切片CA1层放射层记录了场兴奋性突触后电位(field excitatory post-synaptic potentials, fEPSPs)。高频刺激(HFS)诱导LTP,10min后触发CALI。在LTP途径中fEPSPs特异性降低,而在控制途径或表达未融合SN的切片中则没有。随后的HFS产生了fEPSPs的持续增强,表明CALI选择性地擦除了现有的LTP,而不干扰任何未来的可塑性事件。CALI在LTP诱导前1分钟或LTP诱导后50分钟进行时,对电位没有任何影响。由于n-甲基-d-天冬氨酸受体和代谢性谷氨酸受体依赖的长时程抑制(LTD)都将CFL作为共同的下游介质,因此有必要研究CALI对LTD的影响。然而,没有观察到对低频刺激诱导的LTD的影响。

4. 光擦除LTP会在特定时间窗口内损害特定于场景的记忆
研究人员测试了是否能够抹去完好动物的记忆。CaMKIIa-Cre小鼠通过注射AAV2-EF1a-DIO-CFL-SN,在海马CA1背侧双侧表达CFL-SN,并在注射区域上方植入光纤(图2A)。使用抑制性躲避(IA)学习训练评估记忆。在这项任务中,小鼠被放置在一个有灯光的隔间里。它们通常在门打开后30秒内转移到黑暗的一面,在那里它们受到足部电击(图2B)。尽管小鼠(没有注射病毒或光照)在第2天向黑暗方向交叉潜伏期延长,但表达CFL-SN的小鼠在足部电击后2分钟经历CALI后,交叉潜伏期明显缩短,表明记忆形成被破坏(图2C)。在没有CALI的情况下,同样的小鼠在第2天受到电击,并在第3天进行测试后,能够形成记忆,排除了任何对神经元功能的非特异性干扰。表达CFL-GFP或未融合SN的动物即使在有光照的情况下也能正常形成记忆。同样,在没有光照的情况下表达CFL-SN的动物也形成了强健的记忆,排除了CFL-SN的过表达有助于观察到的效果的可能性。

CALI在电击后的不同时间点被触发。当在足部电击后20分钟内进行CALI时,记忆明显受损(图2D)。然而,无论是在动物被放置在IA室前1分钟还是电击后1小时,光线都不会影响动物的记忆。

为了测试受损记忆的场景特异性,研究准备了两个在大小、地板纹理、视觉线索、照明颜色和气味方面不同的IA场景(图2E)。小鼠首先在没有CALI的环境下接受训练。两小时后,小鼠被放置在场景B中,在那里它们显示出短的交叉延迟,表明它们能够充分区分场景B和场景A(图2E)。交叉后,小鼠被电击,随后进行CALI。第二天,当回到场景B时,经历CALI的小鼠显示出更短的交叉潜伏期,表明场景B的记忆被抹去了。然而,当放置在场景A中时,同样的小鼠有交叉潜伏期,类似于那些没有接受CALI的对照组小鼠,这表明场景特定记忆可以选择性地受损。
CALI光擦除记忆-滔博生物.png
图2 CALI光擦除记忆

5. 睡眠时LTP的光擦除也会损害记忆
当动物处于静止或睡眠状态时,与记忆形成相关的海马神经元活动模式会被离线回放,这一过程被认为是记忆巩固的基础。为了确定学习后的长时间内,是否会在海马局部诱导记忆巩固(offline LTP),在小鼠回笼后每20分钟照海马(CFL-SN系统的时间分辨率),从电击后2小时开始,持续8小时。发现记忆被完全抹去(图3A)。当同样一组小鼠在第2天受到电击,并在第3天进行测试时,这些动物表现出了正常的记忆力,排除了非特异性组织损伤。为了进一步缩小LTP的时间窗口,在开始或第二个4小时内进行光照。记忆仍然被抹去。由于局部海马LTP在电击后8小时内仍对居住笼内的记忆形成起作用,接下来测试offline LTP是否会持续数天。只在第2天对海马进行了照射,但没有观察到记忆退化(图3B),这表明offline LTP在学习后延长超过2小时,但巩固存在于海马局部的一段时间。

海马在清醒状态和睡眠状态下都有回放,并且有研究表明这些状态下的事件可能扮演不同的角色。我们分析了这些进程相对于记忆整合进程的状态依赖贡献。在线分析脑电图(EEG)和肌电图(EMG)数据,自动确定动物的行为状态,CALI分别在清醒或睡眠至少20分钟时触发(图3C)。当在睡眠期间进行CALI时,记忆受损(图3D)。然而,在清醒时,没有明显的影响。此外,当CALI在睡眠期间进行,但在第二天,它不再损害记忆形成(图3D)。
睡眠时LTP的光擦除也会损害记忆-滔博生物.png
图3 睡眠时LTP的光擦除也会损害记忆

6. online和offline LTP对海马表征形成的不同作用
两种形式的海马LTP是记忆形成所必需的:线上LTP发生在事件期间或之后,以及线下LTP发生在随后的睡眠期间。使用Inscopix自由活动钙成像显微镜成像自由行为的小鼠海马兴奋性神经元的反应,确定这两种LTP形式是否对海马表征有不同的影响。将AAV9-CAG-DIO-CFL-SN-P2A-GCaMP6f注射到CaMKIIa-Cre小鼠海马背侧,然后将GRIN透镜植入注射部位上方(图4A)。第1天,在没有电击的情况下,记录小鼠暴露于IA室的神经元活动(图4B)。第2天,小鼠再次暴露在相同的房间中,进入黑暗的一面后受到电击。在一组小鼠中,在电击后2分钟,光线通过透镜照射来消除线上LTP(online CALI组)。为了限制对局部环路的影响,在成像侧单方面诱导CALI。在第二组中,每20分钟照明一次(在IA测试后2小时开始照明,共8小时),以消除线下LTP(offline CALI组),而对照组受到电击,但不接受照明(shock noCALI组)。第3天,三组小鼠再次暴露于IA试验室内,记录神经元活动。通过定义每个细胞的选择性评分,比较了习惯室和IA测试室中单个神经元的放电情况(图4C至E)。
海马体的LTP过程在记忆形成和记忆巩固中具有重要作用-滔博生物.png
图4.1 海马体的LTP过程在记忆形成和记忆巩固中具有重要作用

在第1天和第2天,未接受电击的动物的CA1神经元与习惯室相比,在相似水平上对测试室表现出适度的选择性(图4D)。相比之下,在动物被电击(shock noCALI组),与首天相比,第三天在习惯室中的神经元明显更活跃,从而导致整体选择性增加(图4C、E)。在电击后两分钟后擦除线上LTP(shock+online CALI组),没有出现选择性增加。相比之下,擦除线下LTP并没有削弱增加的选择性(shock+offline CALI组)。

为了分析线下LTP对海马突触环路的影响,研究人员使用主成分分析方法(PCA)分析群体Ca2+动力学(图4F)。在只使用电击的小鼠中,在IA学习后,观察到活动反复偏离第1天的轨迹。在观察到这些偏差的时间点,Ca2+信号在两个时间点之间共享的多个细胞中增加(图4G),表明它们反映了特定神经元组的重复同步活动。同步事件主要发生在观测到偏差的时候,而同步事件的数量在电击后增加,尽管平均发射率在第1天和第3天之间没有变化(图4H)。当线上LTP或线下LTP被删除时,PCA的偏差以及同步事件的增加都不明显(图4F和H),这表明了学习后两种形式的LTP对同步活动的重要性。在第3天,开门前在室中心周围观察到同步发放,而开门后,门附近的同步发放较为明显(图4I)。这表明,这种群体活动可能反映了对训练事件的回忆。然后,使用PCA分析将noCALI组的神经元根据它们参与同步事件的程度分为两类,然后分别计算选择性得分(图4J)。参与同步活动至少一次的细胞在学习后(第3天)比学习前(第1天)表现出更高的选择性得分,尽管那些没有参与学习的细胞表现出选择性得分被学习调节的程度降低。然后,根据电击前后选择性评分的变化将细胞分为两组(图4K)。在noCALI动物中,电击后选择性评分增加的细胞比电击后选择性评分减少的细胞更有可能参与同步活动。在线下CALI动物中,参与同步活动的细胞比例总体上低于noCALI动物,并且在电击后选择性得分增加的细胞和那些显示选择性得分减少的细胞之间是相似的。这些结果表明,选择性得分和同步活动之间存在因果关系,而且可以被线下CALI消除。
海马线上LTP和线下LTP在记忆印记形成中有不同的作用-滔博生物.png
图4.2 海马线上LTP和线下LTP在记忆印记形成中有不同的作用

7. 在第二天睡眠时消除ACC中的LTP会损害记忆
为了更进一步探究记忆的转移(海马-皮层),研究人员选择利用CALI抑制前扣带皮层(ACC)的神经元突触可塑性,注意到在小鼠训练后的第二天给光照可以非常有效的擦除记忆,也就是说记忆在学习的第二天就通过建立皮层神经元中的LTP从海马转移到皮层了(图5)。
ACC具有与海马不同的LET时间窗-滔博生物.png
图5 ACC具有与海马不同的LET时间窗

结论
研究人员提供了清晰的证据,表明记忆形成、巩固的早期阶段由突触可塑性的多个步骤组成。本研究中开发出了一个简单的多功能光遗传技术,通过有选择性(时间和空间)的擦除建立起的LTP非常有效地操控记忆的形成、巩固及调用,剖析了突触可塑性事件跨越多个神经元结构和群体,提供了更清晰的记忆巩固图像。通过结合Inscopix自由活动钙成像显微方法,能够识别在记忆巩固过程中经历突触可塑性的神经信号。这为未来对学习记忆的研究提供了一个强有力的技术手段,并且让我们对记忆的认识又先前迈出了重要的一步。

该研究的通讯作者 Yasunori Hayashi 表示:“这项新技术提供了一种方法,可以在细胞水平上分离大脑中时间和空间上的记忆形成。希望这种方法能带来一系列精神障碍的治疗方法,如阿尔茨海默病、学习障碍和精神分裂症等等。”



参考文献:

1.Akihiro Goto, Ayaka Bota, Ken Miya, Jingbo Wang, Suzune Tsukamoto, Xinzhi Jiang, Daichi Hirai, Masanori Murayama, Tomoki Matsuda, Thomas J. McHugh, Takeharu Nagai, Yasunori Hayashi. Stepwise synaptic plasticity events drive the early phase of memory consolidation. Science, 2021; 374 (6569): 857 DOI: 10.1126/science.abj9195

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