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【PNAS文章】KNDy细胞在控制生育能力

发布时间:2022-04-27

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美国肯特州立大学生物科学系助理教授Aleisha Moore博士,艺术与科学学院教授兼副院长Lique Coolen博士以及脑健康研究所教授兼主任Michael Lehman博士在PNAS上发表了题为“In vivo imaging of the GnRH pulse generator reveals a temporal order of neuronal activation and synchronization during each pulse”的文章,在这项研究中,研究人员利用Inscopix自由活动钙成像显微镜这一创新技术揭示了有关大脑生育细胞的令人惊讶突破性的发现,确定了大脑中的哪些神经元控制着生育能力,并揭示了它们对生殖的控制中意想不到的复杂性,这些研究结果可能有助于治疗不孕症。

PNAS_KNDy细胞在控制生育能力_滔博生物.png

意义
下丘脑振荡产生脉动型激素分泌是调节体内平衡系统的基本生理特征。这些神经系统中的单个细胞是如何产生和协调发作性活动以及产生的脉冲分泌的还不清楚。最近,弓形KNDy (kisspeptin/neurokinin B/dynorphin)细胞被确定为生殖所需的促性腺激素释放激素(GnRH)脉冲发生器的关键成分。利用Inscopix自由活动钙成像显微镜观察自由运动小鼠体内KNDy神经元,研究人员发现,在每一次GnRH脉冲之前,单个的KNDy细胞表现出具有显著时间顺序的同步活动,细胞的亚群表现为“领导者”或“追随者”。未来的工作区分这些新的亚群和定义机制的时间顺序的细胞同步可能提供调节脉冲分泌的途径。


摘要
位于弓状核的下丘脑脉冲发生器控制促性腺激素释放激素(GnRH)和促黄体生成素(LH)的发作性释放,对生殖至关重要。最近的证据表明,这个发生器是由弓状核“KNDy”细胞组成的,这个缩写基于kisspeptin, neurokinin B和dynorphin的共同表达。然而,在脉冲过程中,KNDy神经元在单细胞水平上活动的直接视觉证据是缺乏的。在这里,研究人员通过Inscopix自由活动钙成像显微镜成像自由移动的雌性小鼠的KNDy神经元个体以一种偶发的方式同步激活,并且这些同步的偶发总是先于LH pulse。此外,KNDy神经元之间的同步是按时间顺序发生的,在每个同步事件中,一些KNDy细胞的子集作为“领导者”,其他的作为“追随者”。这些结果揭示了GnRH脉冲发生器中激活和同步的一个未知的时间组织,表明在每个脉冲的维持和最终终止过程中,不同的KNDy神经元在脉冲开始时被激活,而在脉冲开始后被激活。进一步研究KNDy“领导者”和“追随者”神经元的区别可能具有重要的临床意义,因为脉动性GnRH分泌的调节对正常生殖至关重要,在多囊卵巢综合征和下丘脑闭经等病理条件下则会被破坏。

结果
GCaMP6在ARC kisspeptin细胞中的表达
使用钙离子指示剂GCaMP6s对弓状kisspeptin神经元进行特异性标记。对含有表达tdTomato荧光团的Kiss1-Cre细胞的中弓状细胞核的代表性投影共聚焦图像(图1 Ai,红色),细胞转染含有钙离子指示剂GCaMP6s的Cre依赖病毒载体(Aii,绿色),直方图描绘了整个ARC腹侧段与Kiss1-Cre/tdTomato共标记的GCaMP6阳性细胞的百分比(图1B和C)。
病毒标记kisspeptin神经元_滔博生物.png
图1 病毒标记kisspeptin神经元
 

在单细胞水平上,KNDy群体显示细胞内钙同步增加
使用Inscopix自由活动钙成像显微镜观察清醒自由运动小鼠体内KNDy神经元,显示单细胞水平上高度同步的发作性活动。在卵巢切除的雌性Kiss1-Cre小鼠,其卵巢中含有ARC kisspeptin (KNDy)细胞表达的GCaMP6s,使用Inscopix自由活动钙成像显微镜对其弓状核内钙活性进行了60分钟的体内成像。定期采集尾尖血液进行LH pulse分析(图2A),显示了清醒和自由运动小鼠荧光(DF/F)的同步和周期性变化(图2D和E)。
在体观察小鼠KNDy神经元的高度同步发放活动_滔博生物.png
图2 在体观察小鼠KNDy神经元的高度同步发放活动
 

KNDy神经元在一个同步的事件中显示了激活的时间顺序和峰值振幅
尽管KNDy神经元之间的活动高度协调,但在一个事件中,所有细胞激活的平均时间为31.28±8.04秒。同样,第一个和最后一个细胞达到峰值振幅的平均间隔为23.51±4.13秒。在同步事件中,KNDy细胞似乎显示出连续的活动,每个细胞激活之间的平均间隔为2.72±0.65秒,每个细胞峰值振幅之间的平均间隔为2.32±0.63秒。因此,作者进一步确定KNDy神经元之间的顺序活动是否以可预测的时间模式发生。通过分析神经元发放的数据发现,KNDy神经亚群,它们的行为要么是“领导者”,要么是“追随者”。“领导者”细胞在激素释放的单个发作期间首先亮起,之后“跟随者”细胞被激活。
在同步事件期间KNDy细胞以可预测的时间顺序激活和达到峰值_滔博生物.png
图3 在同步事件期间,KNDy细胞以可预测的时间顺序激活和达到峰值

 

LH pulse之前有同步的KNDy细胞活动
在整个60分钟的记录期内,从小鼠收集一系列血样,以将KNDy群体活动与LH pulse释放相关联。KNDy群体的同步激活先于LH pulse释放,但当KNDy SEs以高频产生时,这种关系并不完全相关(图4)。
LH pulse由同步KNDy群体活动产生_滔博生物.png
图4 LH pulse由同步KNDy群体活动产生

展望
这项研究集中在一种称为KNDy细胞的神经元亚群上,它决定了从垂体释放激素脉冲以控制生殖器官。研究人员使用Inscopix自由活动钙成像显微镜的创新技术来观察清醒自由活动的小鼠中的这些细胞。
“观察这些神经元并对其进行一般研究是非常困难的,”Lehman教授说。“这需要使用尖端设备和基础设施。” 
他们的研究通过测量在激素释放前点亮的单个KNDy细胞中的荧光蛋白,可视化了小鼠大脑中单个细胞的活性。他们发现了KNDy细胞的亚群,它们的行为要么是“领导者”,要么是“追随者”。“领导者”细胞在激素释放的单个发作期间首先亮起,之后“跟随者”细胞被激活。这些亚群可能是了解大脑如何控制生育能力的关键,并且可能有助于治疗生育障碍,例如多囊卵巢综合征(PCOS)。
Moore博士说:“十分之一的育龄妇女患有PCOS。在这些患者中,垂体激素释放的脉冲增加,这会破坏卵巢功能并导致不孕症。如果我们能够开发出阻断前导细胞活性的药物,从而有效地减缓这些脉冲,这可能为我们可以治疗PCOS患者的卵巢功能障碍和不孕症提供一种新颖的方法。”

参考文献:
Aleisha M. Moore, Lique M. Coolen, and Michael N. Lehman. In vivo imaging of the GnRH pulse generator reveals a temporal order of neuronal activation and synchronization during each pulse. PNAS, 2022; https://doi.org/10.1073/pnas.2117767119

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